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抽丝剥茧,磷酸化/糖基化修饰组学揭示肝母细胞瘤调控机制与潜在治疗靶点

发布时间: 2019-10-31
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肝母细胞瘤(Hepatoblastoma,HB)起源于多能干细胞或肝祖细胞的异常发育,是儿童高度恶性的胚胎干细胞癌。肝母细胞瘤发生罕见、诊断困难,尽管在治疗方面有一定的进步,但仍存在预后较差的现象,早期死亡风险很高。因此充分了解HB的发病机理和分子机制,对于改善HB患者早期诊断、治疗以及预后至关重要。蛋白质翻译后修饰(PTM)是调控蛋白功能,影响细胞通路调控的重要模式。近年的研究也越来越多的通过蛋白质组学系统生物学的手段揭示包括磷酸化、乙酰化、琥珀酰化、糖基化等常见或新型翻译后修饰在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。

2019年10月11日,来自上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心的潘秋辉教授和徐敏教授团队在国际知名期刊Signal Transduction and Targeted Therapy上发表题为“Global profiling of O-GlcNAcylated and/or phosphorylated proteins in hepatoblastoma”的研究论文,宋航博士、马纪博士和卞知玄博士为文章的共同第一作者。研究者以肝母细胞瘤为研究对象,从蛋白质修饰组学的角度,对HB组织与正常肝组织中磷酸化修饰水平和O-糖基化修饰水平进行了大规模鉴定,并研究分析了两种修饰涉及的分子过程。据悉,潘秋辉教授在肝母细胞瘤研究领域已经发表多篇SCI文章,本研究的结果揭示了肝母细胞瘤中关键的修饰调控蛋白,为肝母细胞瘤的机制研究提供了基础。

抽丝剥茧,磷酸化/糖基化修饰组学揭示肝母细胞瘤调控机制与潜在治疗靶点

研究者首先应用4对肝母细胞瘤组织与正常肝组织(样本策略)进行WB以及IHC实验,应用O乙酰葡糖胺修饰泛抗体(PTM-952, PTM Biolabs),研究者发现相较于正常肝组织,HB组织蛋白上存在较高的O糖基化修饰水平。考虑到O糖基化与磷酸化可能共同发生在蛋白相同或不同的丝氨酸或苏氨酸位点,研究者应用景杰生物蛋白质组学技术平台,对上述4对样本开展了基于O糖基化抗体富集的O糖基化修饰组学以及IMAC富集的磷酸化修饰组学(质谱策略)

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图1. WB与IHC实验结果以及修饰组学工作流

在该项目中,共有78个蛋白上114个O糖基化位点以及2088个蛋白上3494个磷酸化位点被成功鉴定到。通过生物信息学分析,研究者发现O糖基化位点具有…T..S…的基序特征,并倾向于在细胞核内参与核酸结合、转录调控、mRNA剪切与加工等功能(图2)。

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图2.糖基化蛋白类型以及参与的分子生物学过程

不同修饰对蛋白质功能的影响各不相同,因此修饰之间的crosstalk对了解蛋白功能调控有着重要的意义,研究者就本次组学数据中同时鉴定到磷酸化和O糖基化位点的蛋白进行系统性分析,发现有52%鉴定到的O糖基化蛋白同时被鉴定到了磷酸化修饰,这些蛋白主要与染色质调控,转录,翻译,转运以及细胞器组成相关;通过PPI网络分析,发现双修饰的蛋白可能在部分细胞信号转导过程中发挥协同作用(图3)。

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图3.O糖基化与磷酸化双修饰蛋白的PPI互作网络分析

在双修饰蛋白中,研究者关注到NPM1,HSPE1以及HSPB1三种参与肿瘤发生过程的蛋白。通过质谱谱图确证以及IP-WB验证,证实了三种蛋白的磷酸化修饰水平与O糖基化修饰水平在肿瘤组织中与正常组织的差异变化(图4)。

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图4.NPM1/HSPE1/HSPB1三种蛋白的MS/MS修饰谱图以及IP-WB修饰验证结果

其中HSPB1蛋白与HB肿瘤细胞系的存活以及化疗耐药性有关。早期的研究表明热激蛋白B-1在包括神经胶质瘤、肝细胞癌、非小细胞癌和乳腺癌等多种人类癌症中异常表达。但在HB细胞系中HSPB-1蛋白的表达和功能却尚未可知,研究者通过实验证明了在HB细胞系中HSPB-1存在O糖基化和磷酸化,且在82位丝氨酸位点,O糖基化与磷酸化存在竞争关系。此外,通过体外药物实验发现,HSPB-1的O糖基化水平能够影响HB细胞对顺铂药物的耐受性,该结果进一步表明,HSPB-1可能是肝母细胞瘤的潜在治疗靶点(图5)。

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图5.HSPB-1蛋白O糖基化修饰影响HB细胞系耐药性

综上所述,本篇研究以肿瘤组织与正常组织为比较组,通过组学大数据和生信分析,首次揭示了热门的磷酸化修饰与目前研究较少的O糖基化修饰在肿瘤组织中的整体修饰图谱以及两种修饰的crosstalk。通过生物信息学分析以及背景研究筛选,抽丝剥茧,找到潜在的修饰影响肿瘤发生机制的关键调控蛋白HSPB-1,并通过实验验证蛋白质修饰组学数据的正确性以及探究修饰的作用机制,为潜在的肿瘤治疗靶点提供理论依据。

参考文献:

Song, Hang, et al., 2019, Global profiling of O-GlcNAcylated and/or phosphorylated proteins in hepatoblastoma. Signal Transduction and Targeted Therapy.


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