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心病还从心上医,FD人类干细胞模型的蛋白质组学研究揭示其关键病理

发布时间: 2019-09-11
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FabryFabrys disease, FD又称为血管角质瘤综合征、安德森-Fabry病,又或是α-半乳糖苷酶A缺乏病,是一种由于X染色体上的GLA基因突变导致溶酶体存储失调的遗传疾病,主要是因为制造α-半乳糖苷酵素的基因α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)发生缺陷,使得无法代谢的脂质堆积在细胞内的溶酶体中,进而引发心脏、肾脏、脑血管及神经病变。



FD的疾病特点表现在GL-3蛋白在全身细胞内逐渐累积,随着疾病的恶化,病人可出现广泛的心肌纤维化和左心室功能受损,心脏病已成为FD患者死亡的主要原因。在FD治疗方面,主要障碍是缺少关于心肌细胞CMsα -gla A缺陷产生的直接后果与导致心脏疾病级联事件之间的知识,特别是在早期阶段,无法获取病人的CMs用于研究。




近日,在Stem Cell Reports期刊上发表了FD疾病病理最新研究成果。研究人员利用FD人类干细胞模型与蛋白质组学研究发现FD疾病中,GLA突变导致溶酶体蛋白LIMP-2在心肌细胞中累积




心病还从心上医,FD人类干细胞模型的蛋白质组学研究揭示其关键病理




研究人员采用源于病人的诱导多能干细胞iPSC和蛋白质组学等技术研究由于GLA突变引起的心脏相关分子和功能后果。该研究的体外实验模型重现了临床上的FD心肌细胞累积GL-3并展示出应激性升高,同时伴随着电生理和钙调控的改变。研究揭示了新的FD潜在心脏标志物,为深入研究FD心肌细胞的早期病理事件提供了有价值的机制性见解。




研究速读



1. 蛋白质组学分析鉴定心肌细胞中FD蛋白标志物


为进行整体的标志物发现筛选,研究人员采用了从iPSC中纯化出的CMs进行LC-MS/MS分析,结果表明在两次重复的对照组和三次重复的实验组中共鉴定到超过4400个蛋白,其中心脏肌节组分MYH6TTNACTC1myosin MYH7ACTN2五种高丰度蛋白的鉴定证明了所检测样本CMs分化的准确性和细胞纯度。为了评估蛋白的差异表达,研究人员通过limma分析得到9个差异表达蛋白cutoff≥0.5 log2 fold-change and adjusted p value <0.1,其中与对照组相比,SCARB2/LIMP-2GBAGALCFD CMs中表达上调,HSPA2/HSP70-2GMPRDNMT3A同样呈上调表达,而FADH2ALDLRENDOG呈下调表达。


心病还从心上医,FD人类干细胞模型的蛋白质组学研究揭示其关键病理

1. 蛋白质组学检测


2. 分泌蛋白组分析鉴定分泌型FD蛋白标志物


为鉴定FabryCMs分泌的不同生物标志物,研究人员采用LC-MS/MS技术检测了条件培养下CMs培养基中分离出的蛋白。结果显示在分泌体中共特异性鉴定到718种蛋白质,其中58%的蛋白包含信号肽。已知的心脏分泌蛋白如心房肽(NPPA)和利钠肽B这两种蛋白占比在90%以上,而在细胞蛋白组中几乎没有检测到,这体现了本次CM分泌蛋白组的真实性。


按照细胞蛋白组相同的筛选差异的条件,在分泌蛋白组中共筛选到20个上调蛋白和14个下调蛋白,尤其是与细胞蛋白组相比在分泌蛋白组中更易检测到的GLA/ɑ-gla A下调最为显著。另外,Fabry CM分泌物中蛋白表达量最高的是CTSF(溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶F,其表达量增加了30倍,其次高表达有心脏强化和心脏保护性相关蛋白HSPsHSPB6/HSP20(22倍)HSP70-2(18倍)。结果表明HSP70-2不仅在Fabry CMs中有升高,在分泌组中具有更高的表达。


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图2. 分泌蛋白质组学检测


3. GLA突变校正和基因敲除支持Fabry生物标志物验证


为了更直接地评估 ɑ-gal A缺陷对CMs的影响,研究人员采用了两种研究策略。第一:校正Fabry iPSC细胞系中的GLA点突变;第二:在野生型hESC/ iPSC系中生成GLAin-del 插入缺失标记)突变,从而产生基因敲除。通过实验进一步证实了LIMP-2在敲除了GLAiPSC-CMs中出现累积,表示对ɑ-gla A缺陷的一种强力应激。相反,SCARB2 mRNA水平没有变化,表明了LIMP-2的累积并不是由于基因表达增加而引起的。此外,WB结果显示CTSFHSP70-2均在基因校正后表达水平明显降低。


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图3. GLA突变校正与基因敲除实验


4. LIMP-2累积驱动Cathepsin FHSP70-2分泌


由于LIMP-2在内溶酶体生物起源中具有重要作用,研究人员针对LIMP-2的累积是否能够单独驱动这些蛋白的分泌提出了假设,然后通过在野生型CMs或者293FT细胞中过表达LIMP-2验证了这一假设的准确性。结果显示胶原IIV水平未受影响,未观察到细胞死亡增加。光镜显示LIMP-2过表达的CMs中液泡形成增加,这是晚期Fabry细胞的一个特征。而在研究的时间范围内,在未经处理的Fabry CMs中没有观察到这些。



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图4. LIMP-2过表达影响检测




综上所述,研究人员通过采用质谱检测的方法在心肌细胞的蛋白质组和分泌蛋白质组中鉴定到超过5500个蛋白,揭示了在FD中溶酶体蛋白LIMP-2累积以及CTSFHSPA2/HSP70-2分泌的现象,而基因校正能够逆转这些改变。此外,过表达LIMP-2可直接诱导分泌CTSFHSPA2/HSP70-2,从而导致大量液泡累积。总之,本研究揭示了新的潜在FD心脏生物标志物,为深入研究FD心肌细胞早期病理提供新的见解。




参考文献
Birket, M. J., et al.,  (2019). A Human Stem Cell Model of Fabry Disease Implicates LIMP-2 Accumulation in Cardiomyocyte Pathology. Stem Cell Reports.

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