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广东省人民医院余学清团队蛋白组学研究揭示Smad4促进糖尿病肾病新机制

发布时间: 2020-04-13
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糖尿病肾病(DN)是导致终晚期肾病的最主要因素,目前其治疗主要依赖于对高血糖和高血压的控制。但是临床发现,糖尿病肾病在许多患者身上仍然继续进展,这表明需要额外的方法来阻止其发展。过往研究发现,TGF-b1/Smad3信号通路在糖肾的疾病发展过程中发挥了重要作用,而Smad3缺乏可防止1型糖尿病肾病小鼠的蛋白尿和肾纤维化,并对高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病具有抵抗力。相比之下,Smad4在糖尿病或糖尿病肾病中的作用知之甚少。

近日,广东省人民医院院长和华南理工大学医学院院长余学清教授,与广东医科大学李锦华教授为共同通讯作者,在著名学术期刊EMBO Reports上发表了最新研究文章,证实Smad4在肾脏中的缺失可以有效阻止2型糖肾小鼠的足细胞损伤和肾小球硬化。足细胞中条件性Smad4缺失可以保护小鼠免于2型糖肾,并且此过程与肥胖无关。高血糖会诱导Smad4定位于足细胞中的线粒体,导致糖酵解和氧化磷酸化减少,并增加活性氧含量。这种结果一定程度上依赖于Smad4与PKM2直接互作,以及对具有活性的四聚体形式PKM2的减少。此外,Smad4与ATPIF1相互作用导致了ATPIF1降解减少。景杰生物为该研究的蛋白质组学定量提供了技术支持。

广东省人民医院余学清团队蛋白组学研究揭示Smad4促进糖尿病肾病新机制

为了明确Smad4在正常和糖肾足细胞中的表达量是否有差异,研究者分别检测了人和小鼠足细胞在病理和生理情况下Smad4的表达。发现Smad4在糖肾足细胞中高表达(Figure 1a),并且Smad4缺乏可显著降低糖肾患者蛋白尿并改善肾功能。研究者进一步利用Smad4缺乏且eNOS-/- 小鼠诱导2型糖肾,发现Smad4缺乏且eNOS-/-糖尿病小鼠的系膜基质扩张和肾小球硬化有明显缓解(Figure 1c)。同时,研究者发现生理情况下,肾脏足细胞Smad4与Tom20(线粒体标记物)的共定位很少,而糖尿病肾小球中Smad4与Tom20明显增多,提示Smad4可能在线粒体中发挥作用。

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图1 肾足细胞中Smad4检测及肾小球PAS染色

为了探讨Smad4缺乏对肾脏的保护作用是否与糖酵解有关,作者分别在WT和Smad4缺乏足细胞中对一系列代谢指标进行检测。在正常和高糖条件下,足细胞中Smad4缺失增强了基础呼吸、最大呼吸和ATP相关呼吸,但没有增加质子泄漏,说明氧化磷酸化活力得到了提高(Figure 2a)。电镜结果显示,这一过程并没有改变线粒体的形态和拷贝数,参与糖酵解的三种限速酶也没有发生蛋白水平的改变。与野生型足细胞相比,Smad4缺乏的足细胞在正常和高糖条件下产生乳酸的能力更强,活性氧(ROS)的产生减少(Figure 2b)。提示Smad4的缺乏可以促进糖酵解,调节氧化磷酸化活性,降低ROS的生成,并防止高糖诱导的足细胞损伤。

广东省人民医院余学清团队蛋白组学研究揭示Smad4促进糖尿病肾病新机制

图2肾足细胞氧耗量,耗氧率,乳酸,活性氧检测

为了进一步研究Smad4调控线粒体氧化磷酸化活性的分子机制,研究者选取正常或高糖处理的Smad4缺乏和WT小鼠足细胞(样本策略)进行了TMT标记定量蛋白质组学研究(质谱策略),共鉴定到5228个蛋白质。生信分析显示,与正常和高糖条件下的野生型足细胞相比,Smad4缺乏导致ATP合酶抑制剂、氧化磷酸化活性调节因子1 (ATPIF1)的蛋白水平降低(Figure 3a)。同时,线粒体丙酮酸载体1 (MPC1)表达下调,而MPC1影响丙酮酸进入线粒体中的氧化磷酸化,以及参与线粒体呼吸链的蛋白,如Ndufs4、Ndufb10、Uqcrb、Cox7a21和Cox5a(Figure 3b)。由于ATPIF1抑制和丙酮酸进入线粒体的限制引起的ATP合酶活性增加导致MPC1的下调,所以,Smad4缺乏可能通过增加线粒体氧化磷酸化,降低线粒体活性氧的生产效率,从而发挥高葡萄糖诱导损伤的保护作用。

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图3 正常或高糖处理的Smad4缺乏和WT小鼠足细胞定量蛋白质组学

除此之外,研究者还证明Smad4对糖酵解过程的调节作用,一定程度上依赖于其与PKM2的直接互作导致了具有活性的四聚体形式PKM2的减少。而Smad4与ATPIF1相互作用则导致了ATPIF1降解减少。

综上所述,本文 利用基于质谱的高通量蛋白质组学技术结合其他方法对Smad4在糖尿病肾病当中的作用进行了综合研究。证实 Smad4在肾脏中的缺失可以有效阻止2型糖肾小鼠的足细胞损伤和肾小球硬化。 足细胞中的Smad4可以通过与PKM2及ATPIF1等蛋白互作,来完成对糖酵解和氧化磷酸化过程的调节,发挥其在糖尿病肾病中的重要诱导作用。此项研究也为后续糖尿病肾病的治疗提供了新的思路和实验依据。

参考文献

1. Jinhua Li, et al., 2020, Smad4 promotes diabetic nephropathy by modulating glycolysis and OXPHOS. EMBO Reports.

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