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景杰生物助力四川大学科研团队在Nat Commun发表原创性论文

发布时间: 2019-01-28
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景杰生物/报道 


编者按:2019年1月25日,四川大学(Sichuan University)华西附二院在国际知名期刊Nature Communications上在线发表文章,题为:Loss-of-function mutations in QRICH2 cause male infertility with multiple morphological abnormalities of the sperm flagella

景杰生物助力四川大学科研团队在Nat Commun发表原创性论文


研究者在2个近亲结婚家系中,发现2名精子鞭毛多发形态异常(MMAF的不育患者,经过全外显子组测序和分析,发现两名患者均存在QRICH2基因的纯合无义突变。


随后研究者利用基因敲除技术,构建了Qrich2基因的KO小鼠,发现Qrich2 KO小鼠表现出MMAF表型, 证明QRICH2为MMAF新的致病基因。同时通过TMT定量蛋白质组学方法并结合功能实验,证实QRICH2能够稳定并上调与精子鞭毛结构发育相关的蛋白,揭示其在精子鞭毛形成过程中的重要作用。


精子缺陷是男性不育的直接原因,包括精子数量减少、能动性降低和形态异常。研究表明超过80 %的男性不育是由精子能动性受损引起的,而精子形态对精子移动起了至关重要的作用。有缺陷的精子形态涉及精子头部、颈部、中段或尾部的多种表型。其中,精子鞭毛的多形态异常( MMAF)包括卷曲、弯曲、不规则、短或/和缺失以及超微结构缺陷。这些因素能导致精子形态异常和活力降低。


尽管MMAF并非罕见的常染色体隐性遗传疾病,但多数MMAF病例的遗传病因仍难以确定。迄今为止,在人类中仅发现了六个与MMAF相关的基因突变: AKAP4CCDC39DNAH1CFAP43CFAP44CFAP69。因此仍需进一步提升MMAF病例中单个候选基因的鉴定能力。


研究者通过全外显子组测序,在来自2个近亲家庭的2MMAF患者中鉴定QRICH2(glutamine rich 2)基因的2个纯合无义突变。之后研究者利用CRISPR-Cas9系统构建了Qrich2 敲除的小鼠模型,其表型与携带QRICH2功能缺失型突变的患者一致。该研究有力的证明了,QRICH2是精子鞭毛形成过程中的重要调控分子,能够调节与鞭毛附属结构相关的基因的表达,QRICH2的功能缺失突变能造成MMAF并引起男性不育。

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图1 本研究的技术路线图


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研究精读
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1、MMAF不育男性的QRICH2发生了功能缺失突变


研究者调查了来自两个近亲家庭的两名MMAF的不育男性,并通过对这两名患者的全血样品进行了全外显子组测序并分析筛选,分别鉴定到QRICH2的192和3037碱基上发生了纯合无义突变,均造成终止密码子的提前出现。


随后研究者利用随即光学重建显微镜(STORM发现QRICH2蛋白主要表达于精子鞭毛轴丝;而免疫荧光实验观察到两名患者的精子中几乎没有QRICH2蛋白表达(图2c),因而表明QRICH2缺失可能是导致精子鞭毛异常的原因。


景杰生物助力四川大学科研团队在Nat Commun发表原创性论文 图2 健康人和患者精子结构差异比较

扫描电镜(a)和透射电镜(b)分别观察到精子尾部形态和超微结构异常;c、免疫荧光实验结果显示患者的QRICH2几乎不表达。


2、缺少Qrich2会导致雄性小鼠的MMAF


人和小鼠的QRICH2的蛋白同源性高达81.8%。研究者利用基因敲除CRISPR-Cas9技术,构建了Qrich2基因的KO小鼠,以确定Qrich2在精子鞭毛发育中的重要作用。通过石蜡切片HE染色、扫描电镜、透射电镜以及计算机辅助精子分析 CASA等一系列实验(图3),结果表明Qrich2的缺失会导致鞭毛结构异常,并且与MMAF患者的临床表型一致,从而有力的证实了QRICH2在精子鞭毛发育中的重要作用其缺失会导致MMAF,并进一步导致男性不育。

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图3 Qrich2-KO小鼠与WT小鼠结构对比

a、KO小鼠在精子鞭毛发育的VI-VIII阶段出现缺陷;b、KO小鼠的附睾切片中很少观察到精子;c、KO小鼠在扫描电镜下观察到精子尾部结构异常;d、KO小鼠中在透射电镜下观察到超微结构异常。


3、QRICH2调节鞭毛发育相关蛋白

为了确定精子鞭毛形成过程中QRICH2蛋白的分子机制,研究者利用TMT标记定量的蛋白质组学方法分析了WTKO小鼠睾丸中的蛋白质表达水平。

蛋白质组学共定量到6849种蛋白,其中差异表达的有108种,其中包括92种下调的蛋白19种上调的蛋白(图4a。进一步分析发现,在下调的蛋白质中,33蛋白质参与精子鞭毛的发育,15蛋白质参与能量代谢,这些相关的蛋白对精子活力至关重要(图4b

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图4 鞭毛发育相关的重要蛋白在QRICH2-KO小鼠中下调表达

a、KOWT小鼠蛋白质组表达分析热图;b、下调蛋白集中于精子鞭毛发育和能量代谢;


其中在下调表达的6个蛋白AKAP3ODF2TSSK4CABYRROPN1MARCH10,先前研究表明它们均与精子尾部的形成直接相关,这些蛋白的功能异常能导致小鼠精子鞭毛发育受损。随后通过western-blot验证该6个蛋白的表达,结果显示与TMT定量蛋白质组学结果吻合;免疫荧光实验表明这些蛋白质主要位于人精子鞭毛中,支持它们在精子尾部形成中的重要作用


研究者还通过HEK293细胞的Co-IP实验证实QRICH2能结合蛋白AKAP3ODF2TSSK4此外,研究者先后对鞭毛发育正常的杂合子QRICH2小鼠以及敲低了RICH2NT2细胞(人睾丸胚胎癌细胞)进行免疫印迹实验,证实了AKAP3ODF2TSSK4CABYRROPN1MARCH10 等6种蛋白的下调是直接由QRICH2的表达减少造成的。综上,QRICH2通过调节精子尾部结构蛋白和能量代谢蛋白的表达参与精子尾部的形成。


那么QRICH2是如何调控上述6种蛋白?研究者进一步对此开展了一系列探索工作。


4. QRICH2在精子鞭毛发育过程中的调控机制


进一步研究发现,QRICH2可以抑制AKAP3ROPN 1的泛素化降解,并作为反式作用因子促进CABYR的表达,从而增强AKAP3ROPN1CABYR在精子鞭毛中的结合。


此外,QRICH2能够通过直接增强ODF2的转录,以及抑制TSSK4的泛素化降解,来调节精子鞭毛中外部致密纤维的形成。总的来说,这些发现揭示了QRICH2通过调节相关信号通路中的关键蛋白,来维持精子鞭毛正常结构(图5)


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图5 ORICH2在精子鞭毛发育过程中的调控机制


5、弱精症患者中检测到QRICH2突变


蛋白质组学分析的结果表明,在Qrich2缺陷小鼠中,与能量代谢有关的几种蛋白质也显著减少。精子鞭毛中的能量代谢为鞭毛跳动提供了滑动力,这直接影响精子的活力。


精子活力降低是弱精症的基本特征。为了研究QRICH2与弱精症患者的联系,研究者150名弱精症患者中QRICH218个外显子及其侧翼内含子区进行了测序。最后通过分析,在6名受试者中观察到6个有害的杂合突变。


值得注意的是,其中2个位点还检测到了罕见的SNPs,因此研究者QRICH2的有害杂合变体和罕见SNPs可能增加弱精子症风险。当然,这一理论需要进一步研究。


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总结
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本研究利用患者及其家系成员的生物样本,结合动物模型揭示QRICH2MMAF的一个新的致病基因。QRICH2作为一个全新的基因目前尚无文献报道其功能。


本研究通过蛋白质组学等一系列的功能实验首次阐明QRICH2在调节精子鞭毛发育过程中的重要机制。此外,遗传学诊断中的基因诊断是男性不育诊疗中必不可少的一项内容,发现与异常表型相关联的基因,并将其作为临床上结合相关特异表型的诊断靶点,是未来男性不育遗传学基因诊断中的一个发展方向。


本研究发现QRICH2 为男性不育新的致病基因,因此QRICH2有害突变的筛选对于男性不育的临床分子诊断具有重要意义。



参考文献:

Ying Shen, et al., 2019, Loss-of-function mutations in QRICH2 cause male infertility with multiple morphological abnormalities of the sperm flagella. Nature Communications.


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